Estudio de Resistencia a la rifampicina y la dapsona en tres pacientes con recurrencia de lepra

Hasta el año de 1982, se utilizaba en el tratamiento de la tuberculosis, una monoterapia, basada en la dapsona.

Por esta misma razón, aparecieron cepas resistentes a Mycobacterium leprae, por lo que la OMS, decidió utilizar una poliquimioterapia (PQT), la cual estaba basada en el uso de dapsona, clofazimina y rifampicina, utilizando como base de la PQT la RIFAMPICINA.

 

Se utilizó a la rifampicina como base, ya que es el antibiótico (de los tres) con mayor actividad bactericida, incluso mayor que los antimicrobianos utilizados específicamente para Mycobacterium leprae.

 

El uso de la dapsona y la clofazimina, es eliminar todas aquellas cepas de M. leprae resistentes a la rifampicina. El uso de este procedimiento ha disminuido la prevalencia de la enfermedad, en países con endemia, la prevalencia ha estado estable, mientras que la recurrencia ha aumentado

 

La recurrencia se ha documentado en pacientes ocn lepra multibacilar que presentaban un alto indice de infección al inicio del tratamiento, y que se continuo su caso luego de terminada la PQT. Se ha documentado también la resistencia a algunas cepas de M. leprae a antimicrobianos utilizados en la PQT tal como la rifampicina. Aunque esta modalidad terapéutica ha limitado la diseminación de la resistencia a la dapsona, se siguen notificando casos resistentes a este medicamento,  incluso en áreas donde la PQT se ha aplicado exitosamente (8, 12, 13).

 

Además, se ha informado de posibles cepas de antimicrobianos, responsables de la recurrencia en casos tratados con monoterapia y PQT (9, 11). La OMS ha planteado la necesidad de vigilar la emergencia de la resistencia a los antimicrobianos, principalmente a la rifampicina, ya que esto puede reducir significativamente la eficacia del tratamiento y obstaculizar la erradicación de la lepra (10, 14).

 

La prueba estándar para determinar la susceptibilidad antimicrobiana de M. leprae es la técnica de la almohadilla plantar del ratón, que además de costosa, demora entre 6 y 12 meses en dar resultados y está disponible en pocos laboratorios (1). Debido a estas limitaciones, se han desarrollado diferentes técnicas moleculares basadas en la detección de mutaciones puntuales en los genes rpoB y folP1 de M. leprae, las cuales se utilizan como marcadores de resistencia a la rifampicina y la dapsona, con una alta correlación con la prueba estándar (8–11, 15, 16). Esto se basa en diversas investigaciones que han demostrado que esas mutaciones puntuales en los genes rpoB y folP1 son las responsables de la resistencia de M. leprae a la rifampicina y la dapsona, respectivamente (8, 15, 16).

 

Se ha podido predecir la resistencia antimicrobiana de algunos aislamientos mediante diversa técnicas de biología molecular que detectan estas mutaciones (9–11).

 

En el municipio de Agua de Dios, departamento de Cundinamarca, Colombia, donde funcionó un sanatorio de reclusión obligatoria para enfermos de lepra entre 1872 y 1961, se han presentado casos de recurrencia de la enfermedad en los que han concurrido factores de riesgo para la aparición de cepas resistentes de M. leprae (17).

El objetivo de este estudio fue detectar la presencia de cepas de M. leprae resistentes a la rifampicina y la dapsona en tres pacientes de ese municipio con recurrencia de lepra y sospecha clínica de resistencia antimicrobiana, mediante la

aplicación de técnicas moleculares.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

 

Pacientes

 

Se realizó un estudio descriptivo retrospectivo en tres pacientes del Sanatorio de Agua de Dios, de Cundinamarca, Colombia, que presentaron de uno a tres episodios de recurrencia de la enfermedad, por lo que se sospechaba que estaban infectados por una cepa resistente a antibióticos (17).

 

Todos los pacientes habían recibido monoterapia con dapsona por más de dos décadas, pero de forma irregular, con dosis variables y no supervisadas, y los pacientes 1 y 2 habían recibido además PQT administrada en iguales condiciones. En el cuadro 1 se muestran los datos principales de los tres pacientes.

 

Obtención y procesamiento de las muestras

 

De cada paciente con recurrencia

—documentada por su historia clínica, baciloscopia y biopsia— se tomó una muestra de las lesiones cutáneas que se conservó en etanol al 70% (18). Esta muestra se utilizó para el análisis molecular de la cepa infectante mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) en el Laboratorio del Grupo de Microbiología Molecular de la Universidad de La Sabana, Chía, Colombia. La extracción y la purificación del ADN

bacilar se realizaron por los métodos de choque térmico (19) y digestión enzimática

con proteinasa K, respectivamente, con el estuche DNeasy® Tissue (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se estandarizó la técnica de RCP denominada touch-down para amplificar regiones de los genes rpoB y folP1 asociadas con la resistencia a la rifampicina y la dapsona, respectivamente (8–11, 15, 16). Para el gen rpoB se utilizaron los cebadores descritos previamente (15), que amplifican un fragmento de 394 pares de bases (pb), y para el gen 74 Rev que amplifican un fragmento de 389

pb. Se emplearon las mismas concentraciones de reactivos y condiciones del termociclador para ambas reacciones.

 

La RCP se realizó en un volumen final de 25 μL de solución tampón de MgCl2 1,5 mM que contenía 1 pM de cada iniciador, 2 μM de cada trifosfato de desoxinucleósido, 2,5 unidades (U) de polimerasa Taq (Promega, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de América) y 5 μL de muestra. Se empleó un  termociclador iCycler (Bio-Rad, Hercules, California, Estados Unidos) con el siguiente programa:

 

5 min de desnaturalización inicial a 95 °C; 11 ciclos de 1 min de desnaturalización

a 95 °C, 1 min de anillamiento a 68 °C (con una disminución de 1 °C por cada ciclo hasta llegar a 58 °C) y 2 min de extensión a 72 °C; seguidos de 27 ciclos de 1 min de desnaturalización a 95 °C, 1 min de anillamiento a 57 °C y 2 min de extensión a 72°C; y un paso final de extensión por 30 segundos a 72 °C. Como control positivo

se empleó el ADN bacilar extraído de una biopsia de piel de un paciente con diagnóstico confirmado de lepra lepromatosa por historia clínica, baciloscopia

y biopsia. Como control negativo de la reacción se usó agua ultrapura y ADN extraído de una biopsia de piel de un paciente con diagnóstico de cicatriz hipertrófica, sin signos ni antecedentes de lepra. Los productos de la RCP se verificaron por electroforesis en gel de agarosa al 2% coloreado con 0,2 μg/mL de bromuro de etidio y se visualizaron en un sistema fotodocumentador con luz ultravioleta (GelDoc XR, Bio-Rad).

 

Secuenciación del ADN

 

Se secuenció el producto de la amplificación mediante el método de Sanger (20) con un secuenciador automático ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos).

 

Los cromatogramas se editaron con el programa Chromas v. 1.45 (Technelysium, Queensland, Australia) y el análisis bioinformático se realizó mediante el alineamiento local con el módulo Water del programa Emboss (21), usando como patrón de comparación las secuencias de una cepa sensible a la dapsona y de otra sensible a la rifampicina (códigos de acceso Z14314 y AB028656, respectivamente, en la base de datos GenBank).

Se identificó la posición de los nucleótidos sustituidos mediante los tres sistemas de referencia descritos (15, 22,23) y se compararon con las mutaciones publicadas (8–11, 15, 16).

 

RESULTADOS

 

Genotipificación de los genes rpoB y folP1 de M. leprae En las muestras de los pacientes 1 y 2 se detectó una mutación puntual en el gen rpoB, localizada en el nucleótido 1367 (TCG ➝ TTG), que produce un cambio de serina por leucina en la posición 456 de la secuencia aminoacídica, según el sistema de numeración empleado en la base de datos Leproma (23) (cuadro 2).

 No se observaron cambios en la secuencia del gen rpoB de M. leprae en el paciente 3, ni en la secuencia del gen folP1 en ninguna de las tres muestras estudiadas. El control positivo empleado mostró ADN de M. leprae sin mutaciones en las regiones estudiadas de los genes rpoB y folP1. Los controles negativos no evidenciaron la presencia del ADN bacilar.

 

DISCUSIÓN

 

En este estudio se demostró por primera vez la presencia de cepas de M. leprae resistentes a la rifampicina en Colombia. Además. A pesar de haberse documentado en las historias clínicas de los tres pacientes estudiados el tratamiento inadecuado con dapsona, no se encontró la mutación estudiada de resistencia a este medicamento.

 

La técnica empleada, basada en la RCP con secuenciación del ADN bacilar amplificado (24), es la más confiable para identificar mutaciones y en esta investigación permitió detectar una mutación en el gen rpoB en las cepas de M. leprae que portaban los pacientes 1 y 2. Esta modificación, descrita inicialmente por Honoré y Cole (15), es específica de las cepas que poseen resistencia a la rifampicina y, como lo han confirmado otros autores mediante la técnica de la almohadilla plantar del ratón, esta es la mutación que se presenta con mayor frecuencia (24). Los resultados de los estudios moleculares concuerdan con los antecedentes y la evolución clínica de los pacientes: un tratamiento irregular y la recurrencia de la enfermedad, condiciones asociadas con el desarrollo de la resistencia a antimicrobianos y con la resistencia secundaria a la rifampicina (2, 9, 11, 24). El paciente 3 no había recibido rifampicina, lo que es consecuente con el hecho de que en las muestras de su biopsia no se detectó la mutación en el gen rpoB, propia de

cepas con resistencia a ese antibiótico.

 

La detección de mutaciones puntuales en el gen folP1 ha sido identificada con una alta frecuencia en las cepas de M. leprae que presentan resistencia alta o intermedia a la dapsona (8, 12, 25, 26).

A pesar de que estos tres pacientes recibieron tratamiento con dapsona de manera prolongada e irregular, en sus muestras no se detectaron mutaciones en la región secuenciada del gen folP1, lo cual podría indicar que aún son sensibles a la dapsona. No obstante, la evolución clínica de estos pacientes indica que presentan resistencia secundaria a la dapsona. Varias hipótesis podrían explicar este resultado: la resencia de bacilos con una baja resistencia, no detectable mediante las técnicas moleculares,

que no se correlaciona con las manifestaciones clínicas (8, 13, 25, 26); la presencia de porinas y mecanismos de reflujo que permiten el transporte del medicamento al exterior de la bacteria, como se ha descrito en otras micobacterias (27, 28); o que las muestras tuvieran una mezcla de bacilos sensibles y resistentes en diferentes proporciones y que la amplificación y secuenciación del genotipo dominante correspondiera al de los bacilos sensibles a la dapsona, como han sugerido otros autores (16, 25).

A pesar del reducido número de casos estudiados, los presentes resultados

permiten afirmar que la metodología molecular empleada puede ayudar a detectar tempranamente una posible recidiva. Esta metodología permitió estudiar sendas regiones de los genes rpoB y folP1 que contienen mutaciones asociadas con la resistencia antimicrobiana.

 

Sin embargo, existen otras regiones génicas que podrían presentar mutaciones relacionadas con la resistencia a antibióticos y que deben ser objeto de estudio.

Debido a la frecuencia con que se ha observado la recidiva de lepra en pacientes

tratados con monoterapia de dapsona durante años (17) es recomendable realizar un seguimiento clínico y baciloscópico anual a fin de detectar tempranamente las posibles recidivas.

  1. #1 por Carlos Iguardia el 18 noviembre, 2010 - 7:50

    Hola Andrea, muy interesante tu publicación, solo quisiera saber si puedes ampliar un poco acerca de la prueba para determinar la susceptibilidad antimicrobiana, la prueba que se realiza en ratas, es que me llamó mucho la atención que se lleven tanto tiempo en entregar los resultados. ¿Por que será?

Responder

Introduce tus datos o haz clic en un icono para iniciar sesión:

Logo de WordPress.com

Estás comentando usando tu cuenta de WordPress.com. Cerrar sesión / Cambiar )

Imagen de Twitter

Estás comentando usando tu cuenta de Twitter. Cerrar sesión / Cambiar )

Foto de Facebook

Estás comentando usando tu cuenta de Facebook. Cerrar sesión / Cambiar )

Google+ photo

Estás comentando usando tu cuenta de Google+. Cerrar sesión / Cambiar )

Conectando a %s

A %d blogueros les gusta esto: